Sponsorlu Bağlantılar

aflatoksin tayini

Gıda Kimyası kategorisinde açılmış olan aflatoksin tayini konusu , ...


Cevapla

 

LinkBack Seçenekler Arama Stil
Alt 11-2008   #1
S Moderator
 
Gülsel ŞEN - ait Kullanıcı Resmi (Avatar)
 
Üyelik tarihi: 22-05-2008
Yaş: 42
Mesajlar: 1.128
Tecrübe Puanı: 81
Gülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond repute


Standart aflatoksin tayini

Sponsorlu Bağlantılar
pul,toz,acı toz kırmızı biber de Aflatoksin B1,B2,G1 ve G2 tayininde kullanılır. Test örneği (8/2-hacim/hacim) CH3OH/H2O ile ekstrakte edilir. Ekstrakt, süzülür solvent konsentrasyonu belli bir değere gelene kadar su ile seyreltilir. Aflatoksin B1,B2,G1,G2, için spesifik antibodyleri içeren bir affinity kolona verilir. Aflatoksinler kolondan CH3OH ile alınır. Miktarları, HPLC’ de kolondan sonra brominasyon ile türevlendirme yapılarak fluorometrik olarak tayin edilir. Brominasyon, Kobra cell ile elektrokimyasal olarak Br2 üretilerek yapılır.

Alet ve Ekipmanlar

• Blender (Waring) : 22000 rpm
• Terazi (XT 10200D Precisa,min=5g e=1g d=0.1g)
• Terazi (XB 220A Precisa, min=0.01g e=0.001g d=0.0001g)
• Filtre kağıdı (24 cm)
• Mikrofiber filtre kağıdı (11 cm)
• Rezervuar
• Vacum manifoldu
• HPLC
o Injection loop: 100 L
o Kolon : 4.6 mm x 25 cm ODS-2
o Detector : Fluorescense ( Ex.: 360 nm, Em.: 430 nm )
• Post Column Derivatization System
o Kobra cell : Rhone Diagnostics Techn. Ltd. Lyon – France
• İmmunoAffinity Columns :
o Enjektör

Kullanılan Kimyasallar

• NaCl

• PBS Solüsyonu(Phosphate buffered saline -PBS- :8 gr NaCl, 1,16 g Na2HPO4, 0,2 g
KH2PO4 ve 0,2 g KCl bir litre saf suda çözülür.
• KBr
• Acetonitrile ( CH3CN )
• Methanol (CH3OH )
• %65 HNO3
• Toluene


• 4M HNO3 : 28.1 mL %65 HNO3 (veya 26.1 mL % 70 HNO3 ) Su ile 100 mL’ ye tamamlanır.
• Ekstraksiyon Çözeltisi: 8 hacim CH3OH + 2 hacim Su karıştırılır.
• Mobil Phase
o Mobil faz-A = 6 Hacim su + 2 Hacim CH3CN + 3 Hacim CH3OH karışımı ile Mobil faz-A hazırlanır.
o Elektrokimyasal olarak Br2 eldesi için, Mobil Phase-A dan alınan 1 L’lik bir porsiyona:350 L 4M HNO3 ve 120 mg KBr ilave edilir. İyice karıştırılır ve çözülür.
• Toluene – Acetonitrile
o 98:2 Toluen:Asetonitril :98 hacim Toluene + 2 hacim Acetonitrile ile karıştırılır.
o 9:1 Toluen:Asetonitril :9 hacim Toluene + 1 hacim Acetonitrile ile karıştırılır.
2.4.1. Aflatoksin Ana Referans Standard Stok Çözeltisi:

Aflatoksin referans standartarı (ana stok çözeltileri) referans laboratuvar olan Ankara İl Kontrol Laboratuvar müdürlüğü’nden temin edilir. Referans laboratuardan temin edilemediği durumlarda :
-Sertifikalı kolon standartları kullanılabilir.
-Aşağıdaki şekilde laboratuarda hazırlanır ve gerçek konsantrasyon hesaplaması yapılır.
Kuru film veya kristal haldeki referans Standardlardan her biri ayrı ayrı balonlara tartılır ve methanol ileçözdürülür .AOAC standart açma metodlarına göre işleme devam edilir. Ana stok standartları hazırlanmış olur.
2.4.2. Aflatoksin Referans Standard Stok Çözeltisinde Gerçek Aflatoksin Konsantrasyonunun Hesaplanması:

Çözücü blank (referans cell) olarak kullanılacak 200-500 nm arasında max. Dalga boyu taranarak bulunur.

350 nm civarındaki (en yakın) max. Absorbans (A) kullanılarak aşağıdaki eşikten Aflatoksinlerin hakiki konsantrasyonları bulunur:

A x MW x 1000
 = Aflatoksin Konsantrasyonu ( g/mL)


MW (Molekül tartısı),  (Molar absorbtivity) değeri Tablo: 1’ den alınır.

Ölçümü yapılan aflatoksin referans standardı tekrar ölçü balonuna iade edilir.

Aflatoksin Mw 
98 Benzene 2 Acetonitrile 98 Toluene + 2 Acetonitrile CH3OH CH3CN
B1 312 19800 19300 21500 20700
B2 314 20900 20400 21400 22500
G1 328 17100 16600 17700 17600
G2 330 18200 17900 19200 18900
Tablo:1 Aflatoksinler için Mw ve  değerleri
2.4.3. Aflatoksin Mıx Referans Standard Ara Stok/2. Düzey Stok Standart Çözeltileri:

Ara stok- 2. düzey standart (98:2, hacim/hacim) Toluene : Acetonitrile kullanılarak, aflatoksinlerin gerçek konsantrasyonları dikkate alınıp hesaplanarak aşağıdaki konsantrasyonlarda tek viale karışık (mix) olarak hazırlanır (2. düzey stok).

Aflatoksin B1 = 1000 ng/ml
Aflatoksin B2= 200 ng/ml
Aflatoksin G1 = 1000 ng/ml
Aflatoksin G2 = 200 ng/ml

2.4.4. Aflatoksin Mıx - 3. Düzey Stok Standart, Kalibrasyon-Günlük Çalışma Çözeltileri:

2. Düzey stok standartdan 1 ml alınır ve 10 ml lik ölçülü balona pipetlenir. Toluene + Asetonitril (98 Hacim + 2 hacim ) çözeltisi yada methanol ile 10 ml ye tamamlanır ve iyice vortekslenir. Oluşan yeni mix karışımın (3. Düzey stok standart) konsantrasyonu B1-G1 0,1 ng/ml, B2-G2 0,02 ng/ml olur.

3. Düzey stok standart çözeltisinden kolon sonrası türevlendirme için karışık kalibrasyon ve analiz standardı hazırlanması: 3. Düzey stok standart çözeltisinden aşağıda ki tabloda verilen miktarlarda viale alınır, çözücü azot gazında ve oda sıcaklığında uçurulur. Her bir viale 1 ml Methanol (HPLC saflığında) eklenir, tüp karıştırıcıda karıştırılarak aflatoksinlerin çözünmesi sağlanır ve ultra saf su ile 2,5 ml ye tamamlanır.Ana stok Methanol ile hazırlanmış ise aşağıda hazırlanan miktarlarda alınarak azot gazında uçurulma işlemi yapılmadan 1 ml methanole tamamlanır. Tüp karıştırıcıda karıştırılır ve 1,5 ml ultra saf su eklenir.

Standard No: Mix Kalibrasyon Çözeltisinden (3. Düzey stok) Alınacak Porsiyonlar ( L) Çalışma-Kalibrasyon Standardının Konsantrasyonu (ng/ml)
B1 B2 G1 G2
1 10 0,400 0,080 0,400 0,080
2 30 1,200 0,240 1,200 0,240
3 50 2,000 0,400 2,000 0,400
4 70 2,800 0,560 2,800 0,560
5 90 3,600 0,720 3,600 0,720

Tablo:2 Çalışma-Kalibrasyon Standartları Hazırlama Tablosu


Hazırlanan bu beş standart HPLC’de altışar defa okutulur ve bu okuma sonuçlarına göre kalibrasyon tablosu oluşturulur. Kalibrasyon tablosu 2-3 ayda bir yenilenir. Her gün okumaya başlamadan önce ve her dört okumadan sonra bu beş standartdan herhangi birisi okutularak makina, mobilfaz ve kalibrasyon tablosu kontrol edilir. Herhangi bir bozulma durumunda bu standartlar yeniden hazırlanır ve yeni kalibrasyon tablosu oluşturulur.
__________________
Bulutlar ağlamasa yeşillikler nasıl güler?
Mevlana
Gülsel ŞEN isimli Üye şimdilik offline konumundadır   Bu mesajdan alıntı yap
Alt 11-2008   #2
S Moderator
 
Gülsel ŞEN - ait Kullanıcı Resmi (Avatar)
 
Üyelik tarihi: 22-05-2008
Yaş: 42
Mesajlar: 1.128
Tecrübe Puanı: 81
Gülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond reputeGülsel ŞEN has a reputation beyond repute


Standart

Sponsorlu Bağlantılar
Ekstraksiyon
KURUTULMUŞ BİBERDE:
Bütün ürünlerde
Her numune iki paralel çalışılır.
İyi örneklenmiş ve öğütülmüş numuneden50 gr tartılıp blendıra konur. Üzerine 5 gr NaCl eklenir.
Blendıra 300 ml methanol : su ( 80 : 20 ) eklenir.
Blendır 30 dakika süre ile çalkalayıcı da çalkalanır.
Yüksek devirde 2 dak. karıştırılır.
Bu dilüsyon kaba süzgeç kağıdından süzülür.
Bu süzüntüden 10 ml alınıp bir behere konur.
Behere 60 ml pbs konup karıştırılır.
İNCİR VE DİĞER KURUTULMUŞ MEYVELERDE:
Bütün ürünlerde
Her numune iki paralel çalışılır.
İyi örneklenmiş ve öğütülmüş numuneden50 gr tartılıp blendıra konur. Üzerine 5 gr NaCl eklenir.
Blendıra 300 ml methanol : su ( 80 : 20 ) eklenir.
Yüksek devirde 3 dak. karıştırılır.
Bu dilüsyon kaba süzgeç kağıdından süzülür.
Bu süzüntüden 10 ml alınıp bir behere konur.
Behere 60 ml pbs konup karıştırılır.
YER FISTIĞI VE DİĞER YAĞLI TOHUMLARDA:
Bütün ürünlerde
Her numune iki paralel çalışılır.
İyi örneklenmiş ve öğütülmüş numuneden50 gr tartılıp blendıra konur. Üzerine 5 gr NaCl eklenir.
Blendıra 200 ml methanol : su ( 80 : 20 ) ve 100 ml Hekzan eklenir.
Yüksek devirde 3 dak. karıştırılır.
Bu dilüsyon kaba süzgeç kağıdından süzülür.
Bu süzüntüden 10 ml alınıp bir behere konur.
Behere 60 ml pbs konup karıştırılır.

. Column Kromatografisi

Bu dilüsyonun tamamı immunoaffinity kolondan süzülür.
Süzülme sırasında kolondan damlalar 1-2 damla/saniye hızında olmalıdır.
Dilüe edilmiş numune süzüldükten sonra kolondan 15 ml su geçirilerek kolon iyice yıkanır. Süzülme sırasında kolondan damlalar 2 damla/saniye hızında olmalıdır.
Yıkama işlemi bittikten sonra temizlenen kolon temiz bir viale alınır ve HPLC saflığındaki methanol’den 0,5 ml alınıp kolona konur. Kolondan methanolun viale akış hızı yer çekimi etkisinde olmalıdır.1 dakika bekledikten sonra 0.75 ml methanol ile aynı işlem tekrarlanır.
Kolon methanol ile iyice yıkandıktan sonra viale 1.75 ml ultra saf su konur iyice karıştırılır.3 ml ye tamamlanır. Vialdeki bu karışım iyice homojenize edilir.
100 l HPLC’ ye enjekte edilir.
Her vialden 2 enjeksiyon yapılır.

HPLC İle Çalışma Ve Post Column Türevlendirme

Kobra-Cell ile Br2 üretilecekse, cihazın montajı için yapımcının talimatları takip edilir. Bu takdirde çalışma parametreleri aşagıda elirtilen şekilde ayarlanır.
Flow rate: 1.00 ml/ min
Current : 100A
1-4 ng/g Aflatoksin B1’i kapsayacak konsantrasyonlarda Referans Standart çalışma çözeltileri en düşük konsantrasyondan başlayarak enjekte edilir. (100l)
Kalibrasyon eğrisi çizilir. Linearite kontrol edilir.
Örnek injeksiyon çözeltisi enjekte edilir. (100l)

Hesaplama
Ekstraksiyonlar sonucunda vialde 3 ml’lik ekstraksiyon solventinin içerisinde 1.66 g numuneyi temsil eder. Bizim hazırlamış olduğumuz kalibrasyon tablosunun dilüsyon faktörü 18’dir. HPLC’nin okuduğu sonuç 18 ile çarpılırsa 1 g numune içerisindeki okratoksin miktarını ng olarak bulunur.

Teşhis Limitleri

Aflatoksin Adı: Tüm ürünlerde (ppb)
B1 0,3
B2 0,2
G1 0,4
G2 0,6

Tablo: 3 Aflatoksinlerin Teşhis Limitleri
__________________
Bulutlar ağlamasa yeşillikler nasıl güler?
Mevlana
Gülsel ŞEN isimli Üye şimdilik offline konumundadır   Bu mesajdan alıntı yap
Alt 04-2008   #3
Cml
Junior Member
 
Üyelik tarihi: 01-11-2008
Mesajlar: 14
Tecrübe Puanı: 12
Cml is on a distinguished road


Standart

Yemlerde de aynı metod kullanılabiliyormu, yoksa ürüne göre çözücü organik kimyasalın değişmesi gerekiyormu.
Cml isimli Üye şimdilik offline konumundadır   Bu mesajdan alıntı yap
Cevapla

Tags
aflatoksin


Konuyu Toplam 1 Üye okuyor. (0 Kayıtlı üye ve 1 Misafir)

 
Seçenekler Arama
Stil

Yetkileriniz
You may not post new threads
You may not post replies
You may not post attachments
You may not edit your posts

BB code is Açık
Smileler Açık
[IMG] Kodları Açık
HTML-KodlarıKapalı
Trackbacks are Açık
Pingbacks are Açık
Refbacks are Açık



Şu anda saat : 01:03 AM.