Geri git   Türkiyenin Gıdacılar Topluluğu - Gıda - Gıda Mühendisleri > Süt ve Süt Ürünleri Teknolojisi > Süte Uygulanan Teknolojik İşlemler
Connect with Facebook
Kayıt ol Arama Yeni Mesajlar Forumları Okundu Kabul Et

Cevapla

 

LinkBack Seçenekler Arama Stil
Alt 19-2009   #1
Moderator
 
Üyelik tarihi: 14-04-2008
Nerden: Akşehir/KONYA
Mesajlar: 529
Tecrübe Puanı: 0
Tecrübe Puanı: 571
Tecrübe Derecesi : AlgaReN is a name known to allAlgaReN is a name known to allAlgaReN is a name known to allAlgaReN is a name known to allAlgaReN is a name known to allAlgaReN is a name known to all
AlgaReN is a name known to allAlgaReN is a name known to allAlgaReN is a name known to allAlgaReN is a name known to allAlgaReN is a name known to allAlgaReN is a name known to all
Exclamation Süt Ve Süt Teknolojisinde Genetik Modifiye

SÜT VE SÜT TEKNOLOJİSİNDE GENETİK MODİFİYE MİKROORGANİZMALAR


Biyoteknoloji,1970’den beri geliştirilen tekniklerle birlikte canlıların genetik yapısında değişikler yapmayı mümkün kılmıştır. Dünyadaki artan nüfusla birlikte beslenme ve daha iyi beslenme, daha sağlıklı çevre, daha iyi sağlık hizmetleri, daha üstün yaşam koşulları taleplerinin yerine getirilmesinde en etkin araç olarak biyoteknoloji görev almaktadır. Biyoteknolojinin talepleri karşılamasında kullanıldığı konularından birini ise süt ve süt teknolojisi oluşturmaktadır. Süt ve süt teknolojisinde rekombinant DNA teknikleri ile renin enzimi üretimi, gen teknolojisi ile elde edilen kimozinin peynir teknolojisinde kullanımı gibi birçok alanda biyoteknoloji kullanım alanları oluşturulmuştur.


1. GİRİŞ

Biyoteknolojinin tarihçesinde beş ayrı evre bulunmaktadır. Pasteur’un canlı mikroorganizmaların fermentasyonunun aktif amilleri olduğunu kanıtlayan çalışmaları sonucu Pasteur öncesi ve sonrası evreler oluşmuştur. Takiben gelişen antibiyotik evresinde fermentasyon sanayine katkılarda bulunulmuştur. Antibiyotik sonrası evresinde ise çeşitli ****bolitler ve enzimleri üretmek üzere mikroorganizmaların yeteneklerini kullanma çalışmalarıyla tanınır. En son evre olan yeni biyoteknolojiler evresi ise genetik mühendisliği v.b. bilimlerin araştırma-geliştirme çalışmalarının kullanılmaya başlamasını kapsamaktadır. (Gıda Teknolojisi Derneği,1990)

1.1 Genetik Modifiye Nedir?

Bir canlı türüne başka bir canlı türünden gen aktarılması veya mevcut genetik yapıya müdahale edilmesi yolu ile yeni genetik özellikler kazandırılmasını sağlayan bu modern biyoteknoloji tekniklerine gen teknolojisi, gen teknolojisi kullanılarak belirli süre sonrasında edinilmesi mümkün olmayan yeni özellikler kazandırılmış organizmalara da Genetik Yapıları Değiştirilmiş Organizma (Genetically Modified Organisms = GMO) veya uluslararası kullanımı ile Living Modified Organisms (Değiştirilmiş Canlı Organizmalar) adı verilmektedir. Ülkemizde genetik aypısı değiştirilmiş ürünler için genel olarak Transgenik Ürün veya Genetik Modifie (GM) gıda tanımı kullanılmaktadır. (

1.2 Gen Teknolojisi Uygulama Aşamaları

Bir canlı türünden genin aktarılması için bir DNA fragmetinin veya bir gen bölgesinin elde edilip çoğaltılması gerekir ve bunun için çeşitli evreler uygulanır.Gen teknolojisinin uygulamaları temelde 5 aşamada gerçekleşmektedir:

1-Restriksiyon endonükleaz enzimi kullanılarak DNA fragmentlerinin elde edilmesi

2-Elde edilen fragmentlerin yine aynı enzimle kesilmiş uygun bir taşıyıcıya (Vektör) aktarımı

3-Fragment-Vektör kompleksinin konakçı organizmaya aktarılarak çoğaltılması (klonlama)

4-Spesifik DNA fragmenti içeren kolonilerin seçimi

5-Klonlanan spesifik DNA fragmentinin tanımlanması
1.3 Genetik Modifikasyonun Avantajları

Genetik modifikasyonun geleneksel üretim yöntemlerine göre aşağıda sıralanan üstünlükleri vardır.
 Ürünlerin yetişmesinde olumsuz etmenlere karşı üstünlük sağlar.
 İstenen değişimler birkaç nesilde sağlanabilir.
 Karakterlerin seçiminde büyük bir kesinlik sağlar.
 Virus kaynaklı olanlar dahil olmak üzere çeşitli zararlılara ve hastalıklara biyojenik direncin artmasının bir sonucu olarak kimyasal pestisitlere olan gereksinim azalır.
 Geciktirilmiş olgunlaşma, artmış nişasta içeriği ve artmış raf ömrü gibi fonksiyonel özelliklerin sağlanması.

2. SÜT VE SÜT TEKNOLOJİSİNDE GENETİK MODİFİYE
MİKROORGANİZMALARIN KULLANIM ALANLARI


2.1 Kluyveromyces lactis’ten Gen Teknolojisi ile Elde Edilen Kimozinin Kaşar Peyniri Üretiminde Kullanımı

Rekombinant DNA teknolojisi ile elde edilen ilk enzim, peynir yapımında kullanılan Maxiren ticari adlı kimozin isimli enzimdir. Peynir üretiminde kullanılan kimozin buzağıların şirdenlerinden elde edilmektedir. 1984-1985 yılları arasında Danimarka’da Chr. Hansen A/S Bio Ingredients şirketi, laboratuvarlarında bu enzimi kodlayan genleri, dana midesinden izole ederek genetik modifikasyon ile Kluyveromyces lactis’e aktarmışlardır ve bu mokroorganizmalar kullanılarak fermentasyon tanklarında kimozin üretimi gerçekleştirmişlerdir.1993 yılına kadar, farklı rekombinant mikroorganizmalar tarafından üretilen kimozin gıda endüstrisinde kullanılması toplam 17 ülkede onaylanmıştır.
Gen teknolojisi ile elde edilen kimozinin peynirlerde kullanım alanı sadece kaşar peyniri ile sınırlı değildir bunun yanında birçok peynir çeşidinde de kullanılabilir.Peynirlerde gen teknolojisi ile elde edilen kimozinin kullanımının standart rennin kullanımı ile farkının görülebilmesi için kaşar peyniri numune olarak kullanılmıştır.Hem gen teknolojisi ile elde edilen kimozin hem de standart rennin kullanılarak peynirlerde fiziksel ve kimyasal analizlerinde farklılıklar gözlenmiştir. Str. lactis subsp. cremoris ve Str. lactis subsp. lactis’ten oluşan karışık liyofilize bulk kültür ile Str. thermophilus, Lb.delbruckii subsp. bulgaricus ve Lb. helveticus’dan oluşan karışık liyofilize bulk kültür olmak üzere iki çeşit starter kültür, çiğ süt, bahsedilen kimozin enzimi ve rennin kullanılarak her iki tür enzim için ayrı ayrı kaşar peynirleri üretilmiştir. Yapılan çalışma ile kaşar peynirinin dört tekrar halinde 25 gün arayla üretim aşamalarında hiçbir değişiklik yapmadan Maxiren ve standart rennin enzimiyle ayrı ayrı üretilmesi ve 1., 15., 30., 60., 90. günlerde peynirlerin fiziksel, kimyasal ( pH, titre edilebilir asitlik, kurumadde, yağ, tuz, toplam azot, suda çözünür azot, tirozin, toplam serbest yağ asitliği ve sertlik indeksi ) ve duyusal (iç görünüş, dış görünüş, yapı, tat, koku ) analizlerin yapılması hedeflenmiştir. Deneme peynirlerinin dış görünüş ve iç görünüş puanlarının olgunlaşma süresince gösterdikleri gelişim incelendiğinde, her iki enzimle yapılan peynirlerin benzer gelişim gösterdiği saptanmıştır. Olgunlaşma süresince tüm peynirlerin gerek dış görünüş puanları, gerekse iç görünüş puanları artış göstermiştir.Sadece standart rennin enzimiyle yapılan peynirlerin dış görünüş puanı önemli olmamakla birlikte 90. günde bir azalma göstermiştir. Bu durumun alınan örnekten kaynaklanabileceği düşünülmektedir. Maxiren ve standart rennin enzimiyle gerçekleştirilen peynir imalatında açığa çıkan peynir sularının bileşimi, ortalama pH değerleri, titre edilebilir asitlik değerleri, kurumadde içerikleri, kurumadde de tuz ve yağ içerikleri sonuçlarının birbirlerine oldukça yakın olduğu gözlenmiştir. Deneme peynirlerin toplam azot yüzdeleri, kurumaddedeki toplam azot içerikleri, suda çözünür azot içerikleri incelendiğinde kullanılan enzim çeşidinin 0.01 önem seviyesinde önem taşımadığı görülmektedir. Olgunlaşma süresince meydana gelen proteoliz nedeniyle tüm peynirlerin tirozin miktarları artış göstermiştir ve Maxirenle yapılan peynirlerin tirozin miktarının biraz daha yüksek olduğu görülmektedir. Bu da bize Maxirenin pepsin içermemesine rağmen standart rennin enzimiyle hemen hemen aynı, hatta biraz daha yüksek proteoliz düzeyinde sahip olduğu sonucunu göstermektedir aynı zamanda bu olgunlaşma açısından önemli bir kriterdir. Maxiren ve standart rennin enzimiyle yapılan peynirlerin suda çözünür azot içeriklerinin toplam azot içeriğine oranlanmasıyla elde edilen olgunlaşma indeks değerleri, oleik asit cinsinden hesaplanan toplam serbest yağ asidi miktarları incelendiğinde kullanılan enzim çeşidinin sonuçlar üzerinde önem arzetmediği görülmüştür. Deneme peynirlerin yapı puanları incelendiğinde, bunların da olgunlaşma süresiyle artış gösterdiği ve kullanılan enzim çeşidi açısından önem arzetmediği tespit edilmiştir. Peynirlerin yapısı hakkında fikir veren kriterlerden biri olan sertlik indeksi değerleri incelendiğinde farklılıkların enzim çeşidi açısından önem arzetmediği görülmüştür.Deneme peynirlerinin tat ve koku puanları incelendiğinde, olgunlaşma süresince gerek Maxirenle gerekse standart rennin enzimiyle yapılan peynirlerin tat ve koku puanlarının birbirine çok yakın olduğu gözlenmiştir. Duyusal değerlendirme sonunda aldıkları toplam puanlar incelendiğinde, Maxiren ve standart rennin enzimiyle üretilen peynirlerin aynı düzeyde beğenildikleri görülmektedir.Sonuç olarak bu çalışma ile, bundan sonra kaşar peyniri yapımında standart rennin enzimi yerine Maxiren’in kullanılabileceği ortaya konulmuştur. Bundan dolayı artık süt emme çağındaki buzağıların kesimine gerek kalmayacak ve artan peynir ihtiyacı karşılamada yeterli düzeyde rennin enzimi mevcut olacaktır.

2.2 Rekombinant DNA Teknikleri ile Rennin Üretimi;

Yeni bir mikobiyal rennet alternatifi olarak birçok firma tarafından geliştirilen, rekombinant DNA teknikleri ile rennin üretimi geliştirilmiştir. İngiltere’de hücre teknikleri ile Saccharomyces cerevisiae Hansen’da buzağı prorennini ve Escherichia coli Castellani ve Chalmers’den de buzağı prorennini sentezlenmiştir ve E.coli’den sentezlenen ile ilk Cheddar peyniri üretilmiştir.
Anon, buzağı mide mukoza hücrelerinden prorennin için mRNA kodunun identifikasyonunun ilk basamağı oluşturduğunu ve bu mRNA’nın renninin prokürsörü olduğunu belirtmiştir. Bu mRNA’dan sentezlenen komplemanter DNA’nın bir plasmide eklenip, uygun bir küf veya bakteri içine aktarılmasıyla prorennin üretiminin sağlanacağı açıklanmıştır. Bu prorenninin asidik pH ile de aktif rennine dönüşümünün sağlayacağı bildirilmiştir.

Collaborative Research Inc.’de cDNA’dan prorennin geni yapılmış ve bu genin E.coli içinde ifade edilmesi sağlanmıştır.Goff ve ark. , prorennin genini mayanın promotor geni ile birlikte plasmide eklemişler ve bu rekombinant plasmidi S.cerevisiae’a transfer etmişlerdir. Bunun sonucunda S.cerevisiae’nın total proteinin %0.5’i oranında intrasellüler olarak prorennin ürettiğini ve enzimin çoğunun eriyebilir formda olduğunu gözlemlemişlerdir. Mellor ve ark. , S.cerevisiae ile daha önce çalışmışlardır ve metiyonin-prorennin sekuensinin diğer rennin sekuenslerine göre daha kuvvetli ifade edildiği ve üretilen renninin total proteinin %5’ini oluşturduğunu kanıtlamışlardır. Celltech Inc.’de çalışan araştırmacılar, prorennin geni ile birleşmede “trp” (tryptofan) promotoru kullanmışlar ve total proteinin %5’i üzerinde ürün almışlardır. Aynı şekilde, Emtage ve ark. ile Moir ve ark. da prorennin genini trp promotoru ile birlikte plasmide eklemişler ve sonra bunu E.coli içinde klonlamışlardır. Nishimori ve ark. ise, prorennin genini lac UV5 promotoruna bağlamışlar ve kullandıkları ifade vektörü E.coli’nin pBR322 plasmidinden elde etmişlerdir. Maat ve ark. , E.coli hücrelerinin modifiye edilmiş plasmidleri ile preprorennin ürettiklerini ve periplazmik boşluklarında preprorennin içerdiklerini bildirmişlerdir. Beppu ve ark. , E.coli modifiye plasmidlerini Bacillus Subtilis’e aktararak çalışmalarını genişletmişlerdir. Nagarajan ve ark. , Bacillus amyloliquefaciens Fukumoto’e aktarılan plasmidin prorenninin ifadesini ve salgılamasını kontrol eden regülatör ve promotor bölgelerini de içerdiğini belirtmişlerdir. Ayrıca B.subtilis’den salgılanan enzimin E.coli’den salgılanan enzime göre doğal forma daha yakın bir konfigürasyona sahip olduğu açıklamıştır.
Pedersen ve ark. , buzağı renninin önce preprorennin olarak salgıladığını, sonra bunun tek bir peptit kaybı ile prorennine dönüştüğünü açıklamışlardır. Aynı araştırıcılar, prorennini aktif rennine dönüşmesinin autokatalitik bir işlem ile asidik pH’da gerçekleştiğini bildirmişlerdir. Uren ve ark. , mikroorganizmalardan üretilen prorenninin aktivasyonu için asidik koşulların yapay olarak oluşturulması gerektiğini ve bunun için de denatüre edilmiş bir ortamın kullanılmasının şart olduğunu belirmişlerdir. Emtage ve ark. , aktif enzimi elde etmek için, transforme edilmiş strainin önce 9 M. üre içinde sferoblast halinde dönüştürülmesini ve sonra dializ işleminin ardından asidik koşulların uygulanması gerektiğini ifade etmişlerdir.
Mikrobiyal rennin üretiminde bu son denemelerden biri de, rekombinant DNA teknikleriyle maya hücresine rennin geninin klonlanması ve böylece yüksek kalitede saf rennin üretiminin mikrobiyal fermentasyonla sağlanmasıdır. Bu tekniğin yakın gelecekte üretiminde kullanılacağı belirtilmiştir.

2.3 Gen Teknolojileri ile Starter Kültür Üretimi

Fermente süt ve et ürünlerinin (peynir, tereyağı, yoğurt, sucuk vb.) yapımında kullanılan starter kültürler, fermente olacak ham besinde istenilen ****bolik aktivitenin gerçekleşmesini sağlarlar. Bu kültürler, ürettikleri ****bolitler aracılığı ile fermente besinin olgunlaşmasını sağlar ve ona özel bir tat ve koku verirler. Günümüzde gen teknolojileri, bu tip mikroorganizmaların genetik yapılarının değiştirilmesi ve teknolojik ve hijyenik uygunluklarının arttırılması ile tüketiciye ve topluma daha sağlıklı, daha lezzetli, daha ucuz ve daha yüksek kaliteli gıda ürünlerinin sunulması için kullanılmaktadır.
Peynir yapımında kullanılan mikroorganizmaların sahip oldukları amino peptidaz enzimleri, süt proteini kazeini daha küçük yapı taşlarına (küçük peptidler ve amino asitler) parçalamakta, ortaya çıkan yapı taşları ise peynire tat ve kokusunu veren bileşiklerin yapımı için öncülük etmektedirler. Ancak bu enzimin oluşturduğu bazı peptidler acı bir lezzete sahiptir ve peynirin kalitesini düşürmektedir. Araştırmacılar, kazeini farklı bölgelerden kıran, dolayısıyla farklı peptidler oluşturan 4 farklı aminopeptidaz enzimine (aminopeptidaz, dipeptidaz, sistein aminopeptidaz ve endopeptidaz) karşılık gelen genleri ayrı ayrı klonlamışlar ve bu genlerin ürünü olan enzimlerle peynir yaparak, farklı enzimleri taşıyan starterlerle hazırlanan peynirleri, rekombinant olmayan orijinal kültür de kontrolü teşkil etmek üzere belli aralıklarla birçok parametre için karşılaştırmışlardır. İki aylık bir olgunlaştırmadan sonra peynirler arasında önemli bir fark bulunamamış, ancak 4. aydan itibaren aminopeptidaz ve sistein aminopeptidaz gen aktarılmış kültürlerle hazırlanan peynirlerin acılığında önemli bir düşüş belirlemişlerdir. Böylelikle, bu enzimlerin gen teknolojisi kullanılarak organizmaya aktarılmasının ardından peynirin organoleptik özelliklerinin iyileştiği belirlenmiştir. Aminopeptidazlarla ilgili bir diğer sorun da bu enzimlerin hücre içi enzimler olması, kazeinin de hücre içine alınamadığından ancak hücre ölümü ve parçalanması (otoliziz) gerçekleştikten sonra bu enzimlerin peynire geçip kazeini parçalamalarıdır. Araştırıcılar, bu sorunu gidermek için bakteri viruslarının (fajların) bakteri hücreleri içerisinde çoğaldıktan sonra konakçı hücrelerin duvarını yıkarak onları parçalama yeteneğinden yararlanmışlar, bunun için bir önceki aşamada elde ettikleri rekombinant organizmalara ayrıca fajdan izole ettikleri lizin adı verilen proteine ait geni klonlamışlardır. Sonuçta, elde edilen rekombinantın daha çabuk otolize olduğu ve bu organizma ile elde edilen peynirlerin lezzet açısından iyi olduğu panelistler tarafından değerlendirilmiştir.
Tereyağına karakteristik tat ve kokusunu veren, laktik asit bakterilerinin çoğalması ve laktik asit üreterek asiditeyi arttırması sürecinde oluşan diasetil isimli bileşiktir. Starter olarak laktik asit bakterilerinin yanısıra Leuconostoc spp. kullanılarak tereyağında istenmeyen bir bileşik olan asetaldehidi parçalayan bakteri türleri kullanılmaktadır. Ancak bu organizma diasetili indirgeyip kokusuz bileşikler olan asetoin ve bütandiyole dönüştürmekte, böylece de stoktaki tereyağı zaman içerisinde tüm koku ve lezzetini kaybetmektedir. Bu sorunu çözmek için, fvML3 lisin geni aktarılmış Leuconostoc spp.’lerin diasetili indirgeme gücü azalmış mutantları elde edilmiş diğer yandan da laktik asit bakterileri genetik manipülasyona tabi tutularak daha fazla diasetil üretmeleri sağlanmıştır.

2.4 Transgenik Bioreaktörlerde Rekombinant Proteinlerin Üretimi

Transgenik hayvanlar kendi genomunda baska bir organizmaya ait rekombinant bir geni tasıyan hayvanlardır. Mikroenjeksiyon teknigi ile üretilen ve daha çok hastalık modellemesi amacıyla gelistirilen transgenik farelerin ilki 1980 yılında yayınlanmıstır.
Fakat, özellikle transfer edilen genin ürününün elde edilmesi, yani, transgenik
hayvanların bir çesit “protein üreten fabrika" olarak kullanılmasıHedeflendiginde bu alandaki çalısmalar da farklı bir boyut kazanmıstır. Temel amaç, elde edilecek ürünün ki bu ürün terapötik degere sahiptir ve tıbbi açıdan son derece degerlidir- bol miktarda ve mümkün oldugunca saf olarak kazanılmasıdır. Aktarılan rekombinant genin (transgenin) ekspresyonunun, promotor gibi gen ekspresyonunu kontrol edici dizilerin yardımıyla transgenik hayvanın belirli dokularına yönlendirilmesi ve böylece hedef proteinin süt ve idrar gibi vücut sıvılarından salgılanmasının saglanması çalısmaları, çok az süt verdiklerinden dolayı farelerin bu amaç için uygun olmadıgını açıkça ortaya koymustur. Varılan nokta, rekombinant proteinlerin üretilmesinde kullanılacak transgenik hayvanların, bol süt veren çiftlik hayvanlarından seçilmesi gerekliligi olmustur. Teknigin ilk adımında, mezbaha materyalinden veya ovaryumlardan oosit pick-up (OPU) ile eldeedilen olgunlasmamıs oositlerin in vitro maturasyonu ve in vitro fertilizasyonu gerçeklestirilmektedir. Daha sonra, pronükleer dönemde bulunan zigotlara mikroenjeksiyon yöntemi ile 2-4 ng/l konsantrasyonda gen konstraktından (transgen) 2 piko litre verilmektedir. Süt alınması temel sart oldugundan, in vitro kültür ortamında morula ya da blastosist asamasına gelen embriyolara *** tayini yapılarak disi olanlar belirlenir. Sonraki adım, disi embriyoların tasıyıcı annelere transfer edilmeleridir. Dogan yavrular arasından transgenik olanlar çesitli moleküler biyolojik yöntemlerle (PCR,Southern Blot) saptanır. Transgenik çiftlik hayvanlarının üretimi ile yılda 1 tona yakın rekombinant protein, ölü insan dokularındakinden çok daha saf, hijyenik ve bol miktarda elde edilebilmektedir.
Transgenik (Tg) hayvanların üretim tekniklerindeki gelişmeler biyoloji, tıp ve
veteriner hekimliği alanındaki araştırmalar için çok sayıda yeni fırsatlar sağlamaktadır.
Transgen teknolojisi aynı zamanda tarım, hayvan ve insan sağlığını içeren diğer alanlarda da önemli açılımlara sahiptir. Kendi genomunda baska bir organizmaya ait rekombinant bir geni taşıyan hayvanlara transgenik hayvanlar denir. Gen transferi, bir hücreli dönemdeki fertilize oositlerin (zigotların) pronükleuslarına mikroenjeksiyon tekniği ile yapılır ve transfer edilen gen (transgen) embriyonun genomu içerisinde rastgele bir yere yerleşir. Bu rastgele gerçeklesen integrasyonun moleküler mekanizması henüz tam olarak bilinmemektedir . Mikroenjeksiyon tekniği ile üretilen ilk transgenik fare ile ilgili makale 1980 yılında yayınlanmıstır. O zamandan günümüze kadar yüzlerce transgenik fare hattı üretilmiştir. Transgenik fareler, genlerin fonksiyonlarının ve gen regülasyonlarının canlı hayvanda çalışılmasına olanak sağlamaları bakımından diğer sistemlere göre daha üstün avantajlar sunmaktadırlar. Transgenik kemirgenler, gen regülasyonu üzerindeki temel çalışmaların yanı sıra, insanlarda görülen birçok hastalıkların hayvan modelleri olarak da kullanılmaktadırlar (alzheimer, cystic fibrosis, AIDS, atherosclerosis, obesity vs.). Uygun yöntemlerle kanser, ****bolik ya da dejeneratif hastalıkların hemen hemen tümü için transgenik fare modelleri geliştirilebilmektedir. Bunlardan başka, transgenik hayvanlar organ naklinde, gen terapisinde kullanılması düşünülen bazı vektörlerin araştırılmasında ve tıbbi öneme sahip bazı rekombinant proteinlerin süt, idrar ve kan gibi çeşitli dokularda üretilmesinde de kullanılmaktadır. Çeşitli rekombinant proteinlerin sözü edilen dokularda sentezlenmesi amacıyla üretilen transgenik HAyvanla ra “biyoreaktörler” adı verilmektedir. Bu güne kadar 50-55 rekombinant proteinin transgenik fare, rat, tavşan, keçi, koyun, domuz ve ineklerin sütünde salınımları sağlanmıştır (Tablo 1). Bu derlemede, biyofarmasötik öneme sahip olan rekombinant proteinlerin transgenik biyoreaktörlerde üretimi üzerinde durulacaktır.

Tablo 1. Bazı hayvanların sütünde eksprese edilen biyolojik olarak aktif proteinleri
Eksprese olan proteinler Hayvan Promotör Ekspresyon Düzeyi
İnsan büyüme hormonu Keçi Retroviral promotör 12 mg/ml
İnsan long-acting tPA Keçi Caprine -casein 3.5-8.0 mg/ml
İnsan protein C Domuz Murine WAP 1 mg/ml
İnsan -antitrypsin Koyun Ovine -laktoglobulin 35 mg/ml
İnsan 1-proteinaz Keçi Caprine -casein 20 mg/ml
İnsan antitrombin III Keçi Caprine -casein 20 mg/ml
İnsan faktör VIII Koyun Ovine -laktoglobulin Veri Yok
_nsan faktör IX Koyun Ovine -laktoglobulin 5 g/ml
İnsan fibribnojen Koyun Ovine -laktoglobulin 5 mg/ml

Kolon kanser MAb
Keçi Caprine -casein 10 mg/ml
İnsan laktoferrin İnek Bovine s1-casein Veri Yok
Alfa-1 proteinaz inhibitör Fare 50 g/l
İnsan büyüme hormonu Fare 5 g/l
İnsan serum albumin Fare 35 g/l
Pro-insülin Fare 20 g/l
Prolaktin Fare 3 g/l
Transgenik çalısmalarda, laboratuar faresi ideal hayvandır. Kısa doğum süreleri (19-
20 gün), çok yavru vermeleri (10-12 adet), yavruların hızlı bir şekilde büyümeleri, kısa
emzirme dönemleri (21 gün) ve transgen yüzdelerinin yüksek olması nedeniyle
kullanılırlar. Herhangi bir gen konstraktı kullanılarak transgenik çiftlik hayvanı elde etmeden önce, bu genleri taşıyan transgenik fareler üretilerek gen ile ilgili gereken kontroller yapılır. Transgenik biyoreaktörlerin elde edilmesinde uygulanan en temel yol,süt, idrar ve kan gibi vücut salgılarında rekombinant proteinlerin üretilmesidir.
Transgenik hayvanlarda bu proteinlerin salınımı meme bezi, tükrük bezi ve idrar
kesesinde gerçekleştirilir. Bu proteinlerin üretimi için, dokuya özgü güçlü promotorlara ihtiyaç vardır. Bunlardan bazıları, koyun -lactoglobulin, fare, rat, tavşan ve keçi whey asid protein (WAP), inek -s1 kazein, rat, tavsan ve keçi -kazein,guniea pig, koyun, keçi ve inek -lactalbumin gibi promotorlardır. Bu güçlü promotorlar, rekombinant proteinlerin sadece hedef dokularda (süt, kan ve idrar) salınmasını sağlarlar. Doğal haldeki süt protein geninin ya da bu genin düzenleyici dizisiyle birleştirilmiş füzyon genin ekspresyonunu, türler arasında bile meme bezine yönlendiren ve süt protein genlerinin 5' (dokuya özgü transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgesi) ve 3' ucunda yer alan translasyona katılmayan bölgelerde kısa korunmuş diziler içerildiği bilinmektedir. Hedef dokuya özgü bu tür düzenleyici DNA dizilerinin kullanılmasıyla herhangi bir genin ekspresyonu istenilen dokuda gerçekleştirilebilir. Süt bileşenlerinin genetik modifikasyonu, meme bezine spesifik düzenleyici diziler aracılığıyla ilgili yapısal genlerin yönlendirilebildiği füzyon genlerin oluşturulması stratejisine dayanmaktadır. Transgenik domuzların meme bezinde kemirgen whey asidik protein geninin ve transgenik farelerde koyun -laktoglobulinin yeterli düzeyde ekspresyonunun sağlandığı örneklerde olduğu gibi, hayvanların normalde sahip olmadıkları genlerin ürünü olan süt proteinleri, farklı türlerin meme bezlerinde eksprese edilebilmektedir. Örneğin, insan doku plazminojen aktivatörü, insan ürokinazı, insan büyüme hormonu ve insan 1-antitripsin gibi birçok farmasötik protein biyoreaktör farelerin meme bezinde üretilmiştir. Günde sadece birkaç damla süt
üretmelerinden dolayı farelerin biyoreaktör olarak kullanımları oldukça güçtür. Fakat, iki yüz adet süt üreten fareden ham rekombinant protein (insan büyüme hormonu gibi) üretimi, meme bezinin disseksiyonuyla ve bunların soğukta birkaç saat süreyle inkübe edilmesiyle 1 grama kadar varan miktarlara yükseltilebilir. Tavşanlar ise süt verimleri endüstriyel uygulama sınırları içerisinde olduğundan biyoreaktör olarak kullanılabilirler ve günlük süt üretimleri dişi başına yaklaşık 100 gramdır. Ayrıca, kısa gebelik süresi (30 gün), çok sayıda yavru (onbeşe kadar) ve sütün yüksek protein içeriği (sığırınkinin üç katı) transgenik tavşanların biyoreaktör olarak kullanımını sağlayan diğer avantajlardır. Transfer edilen genin ekspresyon düzeyinin (tavşan -kazein promotörünün kontrolü altında) düşük olmasına rağmen, araştırmacılar süt veren tavşanların biyoreaktör olarak kullanılabileceğini belirtmişlerdir. Bu bağlamda, insan interlökin-2 proteini ve insan doku plazminojen aktivatörü transgenik tavşanların sütlerinde eksprese edilmiştir. Transgenik biyoreaktörlerde salgılanan rekombinant proteinler genellikle proteolitik yıkımlanmaya karşı dayanıklıdırlar ve çok miktarda elde edilebilirler. Bu bize şimdiye kadar insan materyalinden ya da yetersiz hücre kültürlerinden üretilen proteinleri sınırsız miktarda üretme imkanını sağlamaktadır. Transgenik hayvanların vücut sıvılarından elde edilen rekombinant proteinler insan plazmasından elde edilenlerden çok daha saftır ve insan infeksiyon ajanlarını barındırmamaktadır (hepatit B ve C, HIV ve AIDS). Saflaştırma aşamasında viral inaktivasyon yapılması, transgenik hayvanların spesifik patojen-free şartlarda barındırılması ve üretim standartlarına uyulmasıyla rekombinant proteinler çok saf ve temiz olarak elde edilebilmekte ve böylece ürün kaliteleri yükseltilebilmektedir. Tablo 1’de gösterildiği gibi, insan plazmasında sadece eser miktarda bulunan proteinler, transgenik biyoreaktörlerde endojen düzeylerinin 100-500 katı oranında üretilebilmektedir. Alınan sonuçlar insan Factor VIII (kanın pıhtılasmasını sağlayan mekanizmada rol oynayan proteinlerden biri) gibi üretilmesi çok zor olan proteinlerin bile transgenik biyoreaktörlerin meme bezinde sentezlenebileceğini göstermiştir.
Günümüzde, mezbaha materyalinden veya ovaryumlardan oosit pick-up (OPU) ile elde edilen olgunlaşmamış oositlerin in vitro maturasyonu ve olgunlaşmayı takiben invitro fertilizasyonu rutin şekilde uygulanır hale gelmiştir. Sığır, keçi ve domuz oositlerinde yağ granüllerinin fazla olmasından dolayı döllenmiş oositler (zigotlar), enjeksiyondan önce pronükleuslarının görünür hale getirilmesi için ineklerde 10 dk 12000g ; domuzlarda ise 5 dk 15000g santrifüj edilmelidir. Daha sonra, pronükleer dönemde bulunan zigotlara mikroenjeksiyon yöntemi ile 2-4 ng/l konsantrasyonda gen konstraktından (transgen) 2 piko litre verilir. Mikroenjeksiyonu takiben embriyolar 6-8 gün kadar in vitro kültür ortamında tutulurlar ve bu arada cinsiyet tayini yapılır. Bunun için, morula ya da blastosist aşamasında iken biyopsi yöntemiyle embriyolardan bazı hücre örnekleri alınabilir. Biyopsi uygulanmış embriyolar kültürde tutulurken, biyopsi örneklerinde cinsiyet ve integrasyon analizleri gerçekleştirilebilir. Cinsiyet analizi genellikle polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) yardımıyla yapılmakta ve sığır Y kromozomuna spesifik dizilerin amplifikasyonuna dayanmaktadır. Bu metodun doğruluğu %100'e yakındır. Dişi olarak tespit edilen embriyolar kültür ortamından alınarak senkronize edilmiş alıcı annelere cerrahi veya cerrahi olmayan yöntemler ile transfer edilir. Transgen analizi için ise PCR, Southern, Northern ve Western Blot ile ELISA gibi bazı immunolojik testler kullanılabilir. Hatta cinsiyet ve integrasyon analizleri, uygun farklı primer çiftleri kullanılarak yapılacak PCR reaksiyonu ile tek bir tüp içerisinde gerçekleştirilebilir. Embriyoların alıcılara transferinden önce transfer edilen genin integrasyonunun başarılı şekilde doğrulanması ile, ihtiyaç duyulan taşıyıcı hayvanların sayısı önemli ölçüde azaltılmış olacaktır. Transgeni taşıyan dişiler ilk laktasyona geldikleri dönemde sütlerinden rekombinant proteinlerin izolasyonu sağlanır (Sema 1.) Transgenik çiftlik hayvanlarının maliyeti son derece yüksektir (inek 500.000 $, koyun ve keçi 200.000 $ ve domuz 300.000 $) ve bir transgenik kurucu (founder) hayvan elde etmek için, 1000 inek oositine, 300 koyun ve 200 keçi pronükleer oositine mikroenjeksiyon ile DNA enjeksiyonu yapmak gerekir. Bu bakımdan, transgenik çiftlik hayvanı (biyoreaktör) üretmenin hem maliyeti hem de materyal ihtiyacı (oosit, alıcı anne vs.) çok yüksektir. Bu açıdan, klonlama teknolojisinin bu alandaki önemi de açıkça anlaşılmaktadır. Bu teknolojiyle, uzun bir zaman ve emek harcanarak geliştirilen biyoreaktör çiftlik hayvanlarının sayısını klonlama teknolojisi kullanılarak çok daha kısa bir zaman içerisinde artırmak mümkündür.

Transgenik çiftlik hayvanlarının üretimi sonucunda yılda 1 tona yakın rekombinant protein bu biyoreaktörlerin sütünden izole edilebilir. Tıbbi öneme sahip terapötik proteinlerin kullanımının sağlanması ile milyonlarca insan bunlardan çok daha kolay faydalanacak ve herhangi bir kontaminasyon riski ile karşı karşıya kalmayacaktır. Aynı zamanda, bazı rekombinant proteinlerin başka sistemler ile üretilmesi mümkün olmadığından bu biyoreaktör hayvanlar yeni bir alternatif üretim sistemi oluşturacaklardır. Teknolojinin gelişimine engel teşkil eden bazı teknik güçlükler ortadan kalktıkça bu üretim teknolojisi tüm dünyada pratik uygulama alanları bulabilecektir. Önümüzdeki yıllar içerisinde transgenik teknoloji ile üretilen bazı rekombinant proteinlerin klinik faz 2 denemelerinin bitip eczanelerde satışa sunulması (Örneğin, anti trombin III’ün satışa sunulduğu gibi) beklenmektedir.


KAYNAK; ALINTIDIR
AlgaReN isimli Üye şimdilik offline konumundadır   Bu mesajdan alıntı yap
Cevapla


Konuyu Toplam 1 Üye okuyor. (0 Kayıtlı üye ve 1 Misafir)

 
Seçenekler Arama
Stil

Yetkileriniz
You may not post new threads
You may not post replies
You may not post attachments
You may not edit your posts

BB code is Açık
Smileler Açık
[IMG] Kodları Açık
HTML-KodlarıKapalı
Trackbacks are Açık
Pingbacks are Açık
Refbacks are Açık


Benzer Konular

Konu Konuyu Başlatan Forum Cevaplar Son Mesaj
yoğurt teknolojisinde pastörizasyon adil Yoğurt Üretimi Teknolojisi 8 28-2010 09:29 AM
genetik modifiye gıdalar alperen Yardımlaşma 1 23-2010 11:38 PM
tahıl teknolojisinde uzman birine ihtiyacım var devil_01 Yardımlaşma 2 02-2009 06:32 PM
modifiye nişasta?? alperen Yardımlaşma 1 17-2009 10:30 PM
Genetik Modifiye Tohumların Bugünkü ve Gelecekteki durumu AlgaReN Avrupa Birliği Sürecinde Gıda İle Alakalı Haberler Başlıkları 1 17-2009 03:05 PM



Şu anda saat : 05:21 PM.



Powered by vBulletin® Version 3.8.3
Copyright ©2000 - 2020, Jelsoft Enterprises Ltd.
LinkBacks Enabled by vBSEO 3.6.0 © 2011, Crawlability, Inc.